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来源：康奇生物全国线上运营中心
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2026-07-10 16:55:44
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科研学术
GPComplex甘草多糖新药研发核心技术：结构及质量标准
1、结构确证:
甘草经水煮数小时，水提液静置，除去不溶性杂质，上清液浓缩，然后醇沉并经过醇洗精制得到甘草多糖。甘草多糖过树脂，纤维素柱，浓缩，冷冻干燥得甘草多糖对照品。甘草多糖及其对照品经高效液相(HPLC)、红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、13C核磁共振波谱(13CNMR)、元素分析、纸层析PC、1H核磁共振(1HNMR)等分析，确定了甘草多糖的结构及分子量分布。
2、质量标准制定:
多糖类的质量标准关键在于含量和分子量分布。经过广泛而深入研究，甘草多糖对这两个指标分别选定了最先进准确的检测方法。采用DNS法对多糖含量进行精确的测定。此方法为碱性条件下显色，有效避免了糖苷键在酸性条件下水解的干扰，可以得到单糖的含量数据，从而精确检定多糖的含量。相比仅仅测定总糖含量的苯酚-硫酸法的缺陷，有着明显优势。采用凝胶色谱技术对多糖的分子量及分布做出考察，同时对可能存在的甘草酸、甘草次酸，做出了合理的控制指标。甘草酸、甘草次酸具有水钠潴留的类激素样作用，对它的限量是本质量标准制定中区别于其它类似甘草产品的重要特征。
具体研究内容如下:
分子量与分子量分布 照多糖的分子量及分子量分布测定法(中国药典2000年版二部附录VH)测定重均分子量应70000~120000,分子量分布10%大分子不得大于950000，10%小分子不得小于2000。
色谱条件与系统适用性 用TSK-G4000PW。凝胶色谱柱(7.8X300m)或相当的色谱柱，以0.7%硫酸钠溶液为流动相，柱温为40°C，流速为1.0ml/min,示差折光检测器，进样量20ul理论板数按葡萄糖峰计算应不小于5000,右旋糖酐的分配系数(Kd)应在0~1之间，对照品为己知分子量(重均分子量为7000~130000)的系列葡聚糖。
对照品溶液 取适宜分子量的系列葡聚糖对照品适量，用流动相溶解并制成每1lml中约含3mg的溶液。
供试品溶液 取供试品约65mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相约20ml，超声处理30min，放置室温后，用流动相稀释至刻度，摇匀。以每分钟5000转离心15分钟，取上清液作为供试品溶液。
测定法 精密量取对照品和供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，数据采用GPC专用软件处理。
干燥失重 取本品在105°C干燥4小时，减失重量不得过8.0%(中国药典2000年版部附录WIL)。
重金属 取灰分项下遗留的残渣依法(按照中国药典2000年版一部附录IXE第二法)检查，含重金属不得超过百万分之二十。
总灰分 不得过10.0%(中国药典2000年版一部附录IXK)。
酸不溶灰分 不得过0.5%(中国药典2000年版一部附录IXK)。
砷盐 取本品1.0g，加氢氧化钾的乙醇溶液(1一50)10ml，点火燃烧，缓缓加热灰化，加硝酸2ml湿润，再炽灼灰化约4小时，放冷，用盐酸5ml溶解，依法检查(中国药典2000年版二部附录WIJ第一法)，应符合规定(0.0002%)。
含氮量 取本品0.2g，依法(中国药典2000年版一部附录XL第二法)检查，含氮量不得超过5.0%。
特性粘数 取本品约100mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，用超声波处理30min，放置室温后，加水稀释至刻度，摇匀，以每分钟5000转离心15分钟，取上清液，依法(中国药典2000年版二部附录VIG第三法)测定，特性粘数应为12.4~19.4。
甘草酸、甘草次酸 照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录V D)测定。
色谱条件与系统适用性用十八烷基硅烷键合硅胶(4.6X150mm)为填充剂，以流动相A:甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸(60:40:1)和流动相B::甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸(90:10:1)的梯度洗脱，柱温为45°C，流速为0.8 ml/min,检测波长为254nm,进样量20ul理论板数按甘草酸峰计算应不低于2000，甘草酸铵峰与甘草次酸峰的分离度应符合要求。
对照品溶液 取甘草酸铵与甘草次酸对照品约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取上述各溶液5ml置50ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀。(相当于样品中约含1%的甘草酸与甘草次酸)。
供试品溶液 取供试品约50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相A约20ml，超声处理30min，用流动相A稀释至刻度，摇匀。以每分钟5000转离心15分钟，取上清液作为供试品溶液。
测定法 精密量取对照品溶液 20ul注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使甘草酸铵峰高约相当于记录仪满量程的10-15%，另取对照品和供试品溶液各20ul，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得，甘草酸不得大于1.0%，甘草次酸不得大于0.2%.
含量测定
对照品溶液的制备 取在105°C干燥至恒重的葡萄糖对照品约50mg，精密称定，置200ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀。
测定单糖用溶液的制备 取供试品约400mg精密称定，置100ml量瓶中，加水60ml,在50°C水浴中震荡1小时，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，收集续滤液，即得。
测定总糖用溶液的制备 取本品约100mg，精密称定，至250ml量瓶中，加水100ml，硫酸(18一100)25ml,摇匀，在水浴中水解60分钟，冷却至室温，加数滴酚酞指示剂，加10mo/L氢氧化钠溶液12.5ml，用10%氢氧化钠溶液滴至中性(粉红色)，加水稀释至刻度，即得。
测定法 精密量取上述对照品和供试溶液各2ml，置试管中，加DNS显色液1.5ml,混匀，在水浴中反应15分钟，取出，用冷水冷却至室温，用水转移至25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。照分光光度法 (中国药典2000年版一部附录VA)，在520nm波长处测定吸光度，同法测定空白，计算，即得。
多糖含量(%)=总糖含量(%)-单糖含量(%)
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